背景介紹
2022年8月1日，由國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布YY/T 1805.3-2022《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 膠原蛋白 第3部分：基于特征多肽測定的膠原蛋白含量檢測 液相色譜-質(zhì)譜法》醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)正式實施。該標(biāo)準(zhǔn)適用于組織提取純化的膠原蛋白及其膠原類產(chǎn)品中不同類型膠原蛋白特征多肽含量的測定，并規(guī)定了液相色譜-質(zhì)譜法測定不同類型膠原蛋白特征多肽含量的方法。該標(biāo)準(zhǔn)由全國外科植入物和矯形器械標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品分技術(shù)委員會（SAC/TC110/SC3）歸口，島津中國創(chuàng)新中心使用LCMS-8050參與了新標(biāo)準(zhǔn)的研制和驗證工作，助您一起輕松應(yīng)對新標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用。
標(biāo)準(zhǔn)解讀
膠原蛋白具有良好的生物降解性、生物相容性和弱抗原性，成為應(yīng)用廣泛的生物材料之一。膠原蛋白產(chǎn)品屬于大分子，可用液相色譜法、MALDI質(zhì)譜法，凝膠電泳法對其整體性能進(jìn)行表征。但不同動物來源及不同類型的膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、分子量、等電點等理化性質(zhì)較為相似，上述傳統(tǒng)方法對膠原內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化識別能力有限，無法實現(xiàn)膠原類別的準(zhǔn)確鑒別。本標(biāo)準(zhǔn)基于液相色譜質(zhì)譜特征多肽法可實現(xiàn)不同動物來源不同類型的膠原蛋白的定性和定量檢測，為膠原蛋白產(chǎn)品的定性及純度判別提供了依據(jù)。膠原蛋白是大分子纖維狀蛋白，具有三螺旋結(jié)構(gòu)，本標(biāo)準(zhǔn)采用熱變性處理使其三螺旋結(jié)構(gòu)解旋并溶解，胰蛋白酶酶解后對不同類型膠原的特征肽進(jìn)行檢測。為了減少質(zhì)譜分析時基質(zhì)的干擾并提高方法的準(zhǔn)確性，本標(biāo)準(zhǔn)采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。
本標(biāo)準(zhǔn)的頒布對不同類型膠原產(chǎn)品進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別、規(guī)范動物源膠原的監(jiān)管、提高膠原產(chǎn)品的理化表征能力和生物安全性等方面具有深遠(yuǎn)的意義。
圖1.《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 膠原蛋白第3部分：基于特征多肽測定的膠原蛋白含量檢測 液相色譜-質(zhì)譜法》醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布稿
特征多肽法的原理：篩選已知序列目標(biāo)蛋白中特有且穩(wěn)定存在的肽段，利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測該肽段含量從而推算目標(biāo)蛋白的含量。該方法通常使用胰蛋白酶特異性地酶解精氨酸和賴氨酸的C末端，生成具有堿性氨基酸末端的多肽，因此具有較強(qiáng)的方法專屬性和檢測靈敏度。目前特征多肽法已成功應(yīng)用于膠類中藥的真?zhèn)舞b別，食品中過敏原的檢測以及乳品中A2 β-酪蛋白的含量測定等工作中。
島津三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀LCMS-8050采用全新設(shè)計的加熱ESI源和新型碰撞池UFsweeperⅢ，大幅提高了靈敏度。在確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度和精度的同時，LCMS-8050可實現(xiàn)555 ch/sec的高速MRM采集和5 msec的正負(fù)極性切換。即便對于未完全分離的色譜峰，LCMS-8050也可實現(xiàn)定量離子、參比離子和內(nèi)標(biāo)離子充分的采集。
Skyline軟件是由西雅圖華盛頓大學(xué)的MacCoss團(tuán)隊開發(fā)的一款蛋白質(zhì)靶向分析的專業(yè)軟件，實現(xiàn)了從蛋白質(zhì)到多肽再到MRM離子對檢測列表的轉(zhuǎn)化。其獨特的保留時間預(yù)測功能以及碰撞能量預(yù)測功能使得多肽分析方法的開發(fā)變得更加便捷。島津LabSolutions工作站與Skyline軟件無縫銜接，是靶向蛋白質(zhì)定量方法開發(fā)的得力工具。
分析儀器
表1. 豬I型膠原蛋白特征多肽MRM檢測參數(shù)
*定量離子對
豬I型膠原蛋白特征多肽對照品的典型色譜圖見圖2，二級質(zhì)譜圖見圖3。
圖2. 豬I型膠原蛋白特征多肽對照品典型色譜圖
圖3. 豬I型膠原蛋白特征多肽對照品典型二級質(zhì)譜圖
膠原基生物材料中膠原蛋白的含量檢測是膠原蛋白制品品質(zhì)評價，工藝穩(wěn)定性評價的重要要素。豬I型膠原海綿是一種重要的醫(yī)用膠原制品，其主要成分豬I型膠原蛋白分子量逾40萬，液質(zhì)聯(lián)用儀無法直接檢測。本方法采用碳酸氫銨水溶液稀釋并使用胰蛋白酶酶解。通過檢測豬I型膠原特征肽的含量，折算出膠原海綿中豬I型膠原蛋白的含量。本法具有前處理操作簡便，方法特異性好等優(yōu)點，方法穩(wěn)定可靠，可在膠原醫(yī)療器械產(chǎn)品檢測領(lǐng)域推廣。
-參考文獻(xiàn) -
《YYT 1805.3-2022 組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品膠原蛋白第3部分：基于特征多肽測定的膠原蛋白含量檢測——液相色譜-質(zhì)譜法》
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