生物藥需要對從開發(fā)到運(yùn)輸?shù)拿總€(gè)過程進(jìn)行適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制，這增加了提高分析可靠性和數(shù)據(jù)可追溯性的重要性。在液相色譜分析中由于蛋白質(zhì)和腦的結(jié)構(gòu)中有許多可解離基團(tuán)流動(dòng)相的pH值會(huì)影響高效液相色譜分析中的峰分離。因此，pH值在優(yōu)化分析條件時(shí)起著至關(guān)重要的作用。
通常，流動(dòng)相的pH值只在流動(dòng)相配制過程中進(jìn)行檢查，但是卻忽視了分析期間pH值的變化可能會(huì)對分析性能(如分離度和重現(xiàn)性) 產(chǎn)生負(fù)面影響，特別是在長時(shí)間連續(xù)分析的情形下。另外，pH值數(shù)據(jù)可追溯性也很重要，能在分析結(jié)果不佳的原因和研判分析方法過程中提供至關(guān)重要的信息。
島津流動(dòng)相pH監(jiān)測器pHM-40可以嵌合在色譜系統(tǒng)中 (圖1)，實(shí)時(shí)記錄pH值的變化。pH值信息與所有其他分析信息 (如分析條件、色譜圖和定量參數(shù))一起自動(dòng)存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)文件中，通過LabSolutions 軟件在色譜數(shù)據(jù)文件中隨時(shí)調(diào)用管理pH曲線，確保數(shù)據(jù)的可追溯性和可靠性。寬pH范圍 (1至14) 提供了pHM-40在各種應(yīng)用中使用的可能性。
圖1 ：配置了pH監(jiān)測器的液相色譜系統(tǒng)流路圖
抗體藥物中的聚集體和片段等雜質(zhì)分析通常使用體積排阻色譜法 (SEC)。在體積排阻色譜中，流動(dòng)相pH可以改變單體、聚集體和片段的電荷狀態(tài)，從而改變色譜分離行為?！?/p>
在本應(yīng)用中，考察流動(dòng)相pH值從5.7到7.2時(shí)分離狀態(tài)變化，分析過程中的pH值由pHM-40確認(rèn)并疊加關(guān)聯(lián)至色譜圖，可直觀地確定理想分離狀態(tài)的pH值 (圖2、圖3)
| 表1分析條件 | |
|---|---|
| 系統(tǒng) | Nexera XS inert生物惰性高效液相色譜 |
| 色譜柱 | Shim-packTm Bio Diol-300 (150 mm x 4.6 mm l.D., 2 um) |
| 流動(dòng)相 (自動(dòng)混合) |
A:200mmol/L磷酸鈉緩沖液 B:200mmol/L磷酸二鈉緩沖液 C:1 mol/L 氯化鈉溶液 D:水 |
| 流速 | 0.25 mL/min |
| 柱溫 | 25℃ |
| 樣品 | 單克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品(500 ug/mL) |
| 進(jìn)樣體積 | 5 uL |
| 檢測器 | 280 nm(SPD-M40惰性流通池) |
圖2 pH=7.2時(shí)的色譜圖
圖3 不同pH值時(shí)色譜圖的變化 (放大)
抗體藥物中的電荷異構(gòu)體分析常使用離子交換色譜法。本案例為在西妥昔單抗生物類似藥的電荷異構(gòu)體分析過程中，使用pHM-40進(jìn)行pH值梯度監(jiān)控的應(yīng)用。使用具有不同緩沖能力的HEPES，MES和乙酸鈉溶液等調(diào)節(jié)pH值，可觀察到PH值隨流動(dòng)相B相濃度的增加而從PH5.5線性變化至pH 8.0左右。將流動(dòng)相濃度恢復(fù)到初始濃度后，色譜圖降至基線水平 (約18分鐘)，pH值恢復(fù)到初始值。
(時(shí)間差是色譜柱根據(jù)流動(dòng)相pH值的變化達(dá)到平衡后，流動(dòng)相從檢測器到達(dá)pH監(jiān)測器所需的時(shí)間)測得的pH值可用于準(zhǔn)確估算色譜柱平衡時(shí)間。
| 表2分析條件 | |
|---|---|
| 系統(tǒng) | Nexera XS inert生物惰性高效液相色譜 |
| 色譜柱 | Shim-pack Bio IEX SP-NP ( 100 mm x 4.6 mm l.D., 3 um) |
| 流動(dòng)相 | A: 20 mmol/L HEPES-MES-Sodium acetate (pH 5.0) B: 20 mmol/L HEPES-MES-Sodium acetate (pH 8.2) |
| 梯度程序 | B Conc.0%(0-0.5 min) - 100%(0.5-10 min) - 0%(15.1-25 min) |
| 流速 | 0.6 mL/min |
| 柱溫 | 25℃ |
| 樣品 | 西妥昔單抗生物類似藥(1 mg/mL) |
| 進(jìn)樣體積 | 5 uL |
| 檢測器 | 280 nm(SPD-M40,惰性流通池) |
圖4 西妥昔單抗色譜圖 (含流動(dòng)相濃度梯度曲線和pH曲線
1）蛋白質(zhì)和腦的分析，很容易受到流動(dòng)相pH值的影響，因此有必要在分析過程中監(jiān)測流動(dòng)相pH值。
2）pH曲線可以很容易地疊加在色譜圖上，使所得數(shù)據(jù)文件更加完整，并提高數(shù)據(jù)的可追溯性和可靠性。
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