導讀

      目前HDX-MS裝置的工作流程主要基于Peltier冷卻的 高效液相色譜方法，但該系統(tǒng)價格昂貴成本較高并且在低溫條件下，流動相粘度增加導致高背壓降低了LC的分離效率。而毛細管電泳在HDX領域更具潛力。

     大家好，本周為大家分享一篇發(fā)表在Analytical Chemistry上的文章，Zero-Degree Celsius Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization for Hydrogen Exchange Mass Spectrometry¹，文章的通訊作者為烏普薩拉大學的Erik T. Jansson博士。

　　氫氘交換質(zhì)譜(HDX-MS)適用于研究蛋白質(zhì)在溶液中的動力學和相互作用，其能夠快速分析非變性蛋白中位于蛋白表面的氨基酸序列，廣泛應用于蛋白動態(tài)表位、活性位點的表征。HDX-MS平臺通過低溫UPLC分離提供自動化、在線的樣品處理和分析。目前，HDX-MS裝置的工作流程主要基于Peltier冷卻的 高效液相色譜(UPLC)模塊的LC-MS方法，但該系統(tǒng)價格昂貴，成本較高，并且在低溫條件下，流動相粘度增加導致高背壓(可達-20,000 psi)，降低了LC的分離效率。而毛細管電泳(CE)在HDX領域有著更好的應用潛力。

       CE是一種成熟的分離多種類型分子的方法，在蛋白質(zhì)組學研究中具有獨特的價值。CE基于分析物在電場中的不同遷移率進行分離，分離速度取決于分析物的尺寸和電荷。20世紀90年代初，CE-MS開始應用于肽段水平的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復合物的分析。自此，CE-MS在多肽和蛋白異質(zhì)體的檢測中就顯示出比反相LC-MS高10~100倍的靈敏度。近年來，HDX-MS領域的研究人員也聚焦于探究CE用于HDX-MS工作中的潛在優(yōu)勢。本文利用熔融硅毛細管電泳在零攝氏度下完成了氘代肽段和蛋白的淬滅、酶切和分離，該平臺具有較好的成本效益，易于裝配于任何MS。

　　CE裝置的主要配件包括丙烯酸氣密匣(圖1A)、毛細管液相分離裝置(圖1C)和P-727聚醚醚酮三通組件(圖1D)。丙烯酸氣密匣用于接收N2，內(nèi)部放有一個不銹鋼小瓶裝納氘代背景電解液，能夠允許高電壓傳導到分離毛細管。P-727聚醚醚酮三通組件聯(lián)通高壓電源和N2源，提供分離電壓和N2，在毛細管出口產(chǎn)生離子。

       圖1.Peltier冷卻CE外殼+進樣槽的結(jié)構。(A) 丙烯酸氣密匣。(B) Peltier冷卻單元所粘附的鋁殼體的截面。(C) 毛細管液相分離裝置。(D) 同軸三通閥nano電噴霧針。

　　完成該毛細管平臺(圖1)的加工和組裝后，作者評估了其性能，并將其與先前在微芯片電泳裝置上發(fā)表的報道進行了比較。首先是峰值容量的評估。使用血管緊張素II(ATII)和甲硫啡肽(ME)作為分離標記的淬滅肽標準品，在0 ℃下，以1 % FA、25% ACN (BFS毛細管)和10% HAc(LPA毛細管)組成的氘代背景電解液(BGE)計算峰容量。與BFS毛細管相比，LPA毛細管除了峰容量值增加外，其序列覆蓋率也明顯增加。作者比較了0 ℃ CE到0 ℃ LC和微芯片電泳的峰容量值。結(jié)果顯示，CE的上峰容量雖小于微芯片電泳方法，但序列覆蓋率更高。而與LC相比，CE的峰值容量大大提高。

　　氘質(zhì)子在淬滅時和分析時中的回交(BE)也是HDX實驗主要考察的因素之一。作者使用緩激肽(BK)、ATII和ME作為肽標準品對BE進行了評估。在0 ℃、20 kV的條件下對BFS毛細管和LPA毛細管分別進行測試。結(jié)果表明，ATII在BFS和LPA毛細血管上的BE分別為20 %和34 %。ATII在LPA毛細管上的BE值與已報道的商業(yè)和實驗室改裝的UPLC平臺的數(shù)據(jù)(28~36 %)相似，而在BFS毛細管上則接近直接進樣完全氘代標準品達到的BE水平。此外，由于注入到毛細管中的樣品量與LC所使用的樣品量相比很低，在檢測的質(zhì)譜中沒有出現(xiàn)任何殘留的跡象。

　　作者對溶液中牛血紅蛋白(Hb)進行了HDX，隨后又進行了淬滅、胃蛋白酶酶切、低溫毛細管電泳分離與質(zhì)譜(MS)檢測。圖2顯示了根據(jù)Kyte-Doolittle疏水性指數(shù)選擇的6個肽段在不同分離條件下相應的電泳圖譜和氘代速率。從圖中可以看出，LPA毛細管上分離的肽段峰形更對稱，信號強度比BFS毛細管上高一個數(shù)量級左右。與BFS毛細管相比，LPA涂層的毛細管整體的氘標記保留絕對值較低，但氘代速率沒有檢測到差異。雖然BFS毛細管遷移時間更快，但由于BFS毛細管在樣品進樣之間需要更多的沖洗步驟，因此分析時間比使用LPA毛細管要長。

       圖2.強度歸一化的提取離子電泳圖譜，顯示了BFS和LPA毛細血管之間遷移時間的差異，以及標記Hb的消化性中的6個代表性肽的HDX動力學圖。橙色的跡線顯示了使用BFS毛細管分離的結(jié)果，紫色的跡線顯示了使用LPA涂層毛細管分離的結(jié)果。肽段序列的注釋及其對應的Kyte-Doolittle疏水性指數(shù)顯示在右方。(左)在500 s標記時間點顯示了代表性的峰形和遷移時間。(右)BFS毛細管中的氘代保留更高。誤差棒表示一個標準差，每個時間點n = 3。有些多肽在所有孵育時間內(nèi)只存在于LPA涂層中，因此上述六個面板其中的兩個面板沒有在BFS毛細管中的痕跡。α 136 - 141在BFS毛細管上分離的特定樣品在500 s時間點顯示，但在以后的時間點沒有足夠的質(zhì)量，從最終的數(shù)據(jù)集中省略，因此HDX動力學圖不包括該肽段。β 35 - 40沒有被檢測到，也未被包括在HDX動力學圖中。

　　 ，本文研究了HDX CE-MS平臺在表征結(jié)構相關信息方面的作用。作者比較了非變性條件下的Hb樣品與用6 M尿素置于變性條件下的Hb樣品的相對氘代值。研究發(fā)現(xiàn)，在非變性狀態(tài)下更容易受到HDX保護的位點與Hb亞基的相互作用位點相吻合。具體來說，α-Hb上的R32-Y43和L92-D127以及β- Hb上的R29-E42和D98-Q130與這兩個單體相互結(jié)合的位置相吻合。數(shù)據(jù)顯示(圖3)，與局部區(qū)域的尿素暴露狀態(tài)相比，Hb的非變性狀態(tài)對HDX的敏感度降低。這一發(fā)現(xiàn)驗證了該方法可作為結(jié)構蛋白質(zhì)組學研究的潛在工具——能夠表征分子結(jié)合和構象動力學，如蛋白質(zhì)-配體相互作用中遇到的問題。

       圖3. Hb的HDX數(shù)據(jù)在PDB 1FSX上的映射。在非變性條件下用D2O標記的Hb與用6 M尿素變性后標記的Hb進行比較。顏色刻度表示50,000 s氘摻入后，天然/尿素D吸收量的比值。

　　總的來說，本研究提供了低溫CE - MS應用于溶液內(nèi)標記HDX的理論證明。盡管BFS毛細管提供了快速的肽段分離和標記肽段的較小氘損失，但研究結(jié)果表明LPA涂層的毛細管在HDX CE - MS中更有優(yōu)勢。有很多途徑能夠?qū)崿F(xiàn)該平臺的進一步優(yōu)化，包括但不限于BGE優(yōu)化(pH、有機質(zhì)含量、濃度)、濃縮/脫鹽步驟、固定化/嵌入式蛋白酶消化、升級Peltier元件以實現(xiàn)更低溫的分離、集成無鞘電噴霧界面、交替毛細管涂層和評估更長或更短的毛細管。

　　撰稿：陳鳳平

　　編輯：李惠琳，羅宇翔

　　文章引用：Zero-Degree Celsius Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization for Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

　　參考文獻

　　1. Aerts, J. T.; Andren, P. E.; Jansson, E. T., Zero-Degree Celsius Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization for Hydrogen Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2022.

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