超薄切片機(jī)需要使用玻璃刀，為電鏡和光鏡提供超薄樣本切片。
對(duì)于樹脂切片和冷凍切片（Tokuyasu樣本）的玻璃刀，其刀鋒非常鋒利、堅(jiān)固、穩(wěn)定。采用斷裂法制備良好玻璃刀時(shí)，玻璃條的質(zhì)量非常重要。玻璃條由精選玻璃生產(chǎn)而成，厚度和質(zhì)量均經(jīng)過準(zhǔn)確把控。只有采用高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來嚴(yán)格把控公差，才能從一塊玻璃中制出兩把良好玻璃刀。
圖1：成刀
平衡斷裂概念
在科學(xué)級(jí)質(zhì)量的玻璃條中制造受控的筆直斷裂，要求制刀機(jī)在劃痕的兩側(cè)施加相同的重量和壓力。此外，從底部接觸玻璃的支撐元件盡可能減小表面接觸，以免在斷裂之前對(duì)玻璃施加非受控的壓力。
采用平衡斷裂法（圖2）制刀時(shí)，一根玻璃條會(huì)從中間劃痕處斷裂成相等的兩半。劃痕兩側(cè)的玻璃重量相等，斷裂是平衡的，新產(chǎn)生的斷裂面是平整的。不斷將新產(chǎn)生的玻璃條斷成相等的兩半，可以得到一定數(shù)量的方形玻璃板。
所有方形玻璃板都擁有平直的側(cè)邊以及準(zhǔn)確的直角，而連續(xù)斷裂法得到的方形玻璃板的表面常常會(huì)彎曲變形。
圖2：平衡斷裂法
劃痕和斷裂原理
制作高質(zhì)量玻璃刀通常需要制作出一批相等的方形玻璃板，在玻璃上準(zhǔn)確地劃出劃痕，準(zhǔn)確地施加壓力，使其斷裂。
通常情況下，當(dāng)斷裂發(fā)生在靠近拐角的地方（長劃痕）時(shí)，刀鋒更加平直，對(duì)面刀肩更窄。過去建議使用短劃痕制作冷凍超薄切片，因?yàn)檫@樣一來自由斷裂的時(shí)間較長，可以制得鋒利、至長的可用刀鋒[1, 2]。
每個(gè)劃痕已經(jīng)預(yù)設(shè)好，劃痕距離方塊兩個(gè)角的距離相等。斷裂發(fā)生時(shí)，玻璃下方墊著兩枚不銹鋼半球，上方則由兩枚斷裂銷固定。這種斷裂可以讓劃痕向其兩側(cè)盡可能地延伸，直至自由斷裂發(fā)生。自由斷裂的方向由斷裂兩側(cè)玻璃的重量以及兩側(cè)施加的力決定
自由斷裂向方形玻璃板的邊緣彎曲，終制得一把刀，且刀鋒對(duì)面出現(xiàn)平邊（刀肩）（圖3a）。若劃痕沿著方塊的中心延伸，則產(chǎn)生的刀肩會(huì)非常窄，此時(shí)刀的角度更加接近45°（圖3b）。
這是冷凍超薄切片的優(yōu)選設(shè)置。進(jìn)行樹脂切片時(shí)，則可以將刀肩設(shè)置得稍微大一些（~0.5 mm），產(chǎn)生更大的刀角度，這樣能更加穩(wěn)定。
圖3a
圖3b
玻璃刀真實(shí)刀角度
在方形玻璃板上劃出劃痕時(shí)，所有劃痕距離方形玻璃板直角還有一定距離。對(duì)劃痕兩側(cè)施加壓力，斷裂開始，首先可以看到劃痕開始變深。斷裂沿著劃痕向方形玻璃板兩角延伸。劃痕到達(dá)兩個(gè)角后，自由斷裂開始。斷裂沿著劃痕延伸，到達(dá)兩角時(shí)向方形玻璃板的一邊偏離彎曲。因此，玻璃刀的真實(shí)刀角會(huì)略大于劃痕角度。
玻璃刀的真實(shí)角度會(huì)隨著劃痕偏離對(duì)角線角度的加大而加大。這種情況下，刀肩就會(huì)變寬。
例如，用方形玻璃板制作玻璃刀時(shí)，若刀肩較?。?lt;0.5>0.5 mm）后，會(huì)進(jìn)一步放大真實(shí)刀角度，甚至可能使其大于55°（圖4）。
圖4
可用刀鋒長度
在暗場(chǎng)照明下用體式鏡來檢查玻璃刀刀鋒（或用超薄切片機(jī)并使用背光燈照明），可以看出刀鋒的中間部分zui shi he用來做超薄切片。刀鋒右側(cè)有可見的毛刺（鋸齒狀），會(huì)使刀的質(zhì)量下降。受應(yīng)力線影響，刀鋒左側(cè)也不適合做切片（圖5）。
從應(yīng)力線離開刀鋒到刀鋒出現(xiàn)毛刺（鋸齒狀），這一段刀鋒可用做超薄切片。
圖5
注 意
使用8 mm玻璃條比使用6.4 mm玻璃條多30%可用刀鋒長度！
方形玻璃板斷裂成玻璃刀時(shí)，施加的力越小，應(yīng)力線就會(huì)越快離開刀鋒，鋸齒狀毛刺也更少。這樣一來，可用刀鋒長度就會(huì)更長。
檢查刀鋒
制得一對(duì)玻璃刀后，可以在超薄切片機(jī)上檢查刀鋒質(zhì)量。
使用背光燈照明，將間隙角設(shè)置為至大值，可以看見一道非常細(xì)的白線（圖6）。這條線可用于判斷刀鋒的質(zhì)量，白線平直、無塵、無油漬、無指紋、無玻璃毛刺。
另外，也可以使用頂燈照明觀察玻璃刀的刀鋒質(zhì)量（圖7）。
圖8所示玻璃刀質(zhì)量不合格，不能使用。抓取玻璃刀時(shí)，指紋留在了刀鋒上。
圖9（頂部）展示了一對(duì)玻璃刀，它們?cè)跀嗔押蟛⑴欧胖谩D中（圖9底部）還展示了兩把玻璃刀的刀肩細(xì)節(jié)。在斷裂過程中，右側(cè)刀鋒與左側(cè)刀肩對(duì)應(yīng)，左側(cè)刀鋒與右側(cè)刀肩對(duì)應(yīng)。
圖6
圖7
圖8
圖9
參考資料：
1. Griffiths G, Simons K, Warren G and Tokuyasu KT: Immunoelectron microscopy using thin, frozen sections: Application to studies of the intracellular transport of Semliki Forest virus spike glycoproteins. In: Methods in Enzymology 466–485 (1983).
2. Tokuyasu KT: Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy 143 (2): 139–149 (1986).
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