前沿顯微成像技術(shù)專題——轉(zhuǎn)盤式共聚焦顯微鏡

傳統(tǒng)的熒光顯微技術(shù)在生物成像領(lǐng)域有兩個(gè)難以克服的挑戰(zhàn)：一是對(duì)生物樣品的結(jié)構(gòu)做3D成像。在傳統(tǒng)寬場(chǎng)熒光顯微鏡中，照明光會(huì)照亮光路上的整個(gè)樣品，來(lái)自非焦平面的雜散光信號(hào)也會(huì)被成像物鏡收集到（圖1），干擾所要觀察的的樣品信號(hào)，不但降低橫向分辨率，軸向分辨率也只能達(dá)到2.5µm左右，比大多數(shù)生物結(jié)構(gòu)都要大，因此很難對(duì)樣品3D結(jié)構(gòu)清晰而準(zhǔn)確地成像；另一個(gè)挑戰(zhàn)是對(duì)樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰成像。在觀察細(xì)胞內(nèi)部活動(dòng)時(shí)，細(xì)胞膜的熒光信號(hào)會(huì)對(duì)成像產(chǎn)生大的干擾

                圖1 小鼠腎臟切片（厚度20µm）分別在 (a) 寬場(chǎng)和 (b) 熒光共聚焦顯微鏡下的成像效果。

               哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞（厚度50µm）分別在 (c) 寬場(chǎng)和 (d) 熒光共聚焦顯微鏡的成像效果。Scale bar: 20µm。

如何排除這些來(lái)自非焦平面的干擾信號(hào)呢？早在1953年，美國(guó)學(xué)者馬文·明斯基就提出了“共聚焦”的構(gòu)想。經(jīng)過(guò)30年的發(fā)展，這一想法逐漸成為今天非常成熟的共聚焦顯微成像技術(shù)。“共聚焦”的原理就是在樣品的共軛焦平面上添加一個(gè)帶有“針孔”的擋板（圖2）通過(guò)針孔阻斷雜散光，提高分辨率和對(duì)比度。共聚焦顯微鏡具有較好的光學(xué)切片能力，軸向分辨率可提高到500 nm左右。

圖2 共聚焦原理示意：位于共軛平面上的針孔阻擋了來(lái)自樣品上方 (a) 和下方 (b) 的雜散光，只有來(lái)自焦平面的光才能通過(guò)針孔進(jìn)入探測(cè)器（c）。

傳統(tǒng)的激光掃描共聚焦顯微鏡使用逐點(diǎn)掃描，用光電倍增管（PMT）作為檢測(cè)器，雖然成像清晰，但是速度比較慢。而且PMT的光電轉(zhuǎn)換效率也比較低，需要較強(qiáng)的激發(fā)光。這就導(dǎo)致這種技術(shù)的光漂白和光損傷非常大，不適用于活細(xì)胞成像。

為了對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行快速成像，我們本期專題的主角——轉(zhuǎn)盤式共聚焦顯微鏡閃亮登場(chǎng)了。

圖3 帶有阿基米德螺旋狀針孔的Nipkow Petran轉(zhuǎn)盤Nipkow Petran轉(zhuǎn)盤。針孔直徑為d，間距為s。

轉(zhuǎn)盤式共聚焦顯微鏡的原理是在物鏡像平面上放置一個(gè) Nipkow 轉(zhuǎn)盤，轉(zhuǎn)盤上分布著排列成阿基米德螺旋的針孔（圖3），激光光源覆蓋所有針孔的范圍（即掃描區(qū)域），每當(dāng)轉(zhuǎn)盤旋轉(zhuǎn)30°，一個(gè)針孔就掃描圖像上對(duì)應(yīng)的一塊區(qū)域，以此來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的完整掃描。與傳統(tǒng)的點(diǎn)掃描方式相比，這種多點(diǎn)同步掃描方式不僅大大提高了采集速度，也意味著可以使用面陣相機(jī)（背照式sCMOS或EMCCD）取代PMT，提高量子效率，從而降低激發(fā)光功率，大大降低了對(duì)樣品的光漂白和光損傷。轉(zhuǎn)盤共聚焦模塊通常是獨(dú)立的，可以加在顯微鏡的相機(jī)端口（圖4）。圖像亮度、對(duì)比度和光學(xué)切片質(zhì)量都可以通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)盤性能得到改善。

           圖4 Yokogawa CSU-X1轉(zhuǎn)盤共聚焦裝置示意。該裝置包括電動(dòng)旋轉(zhuǎn)針孔盤和微透鏡盤，可安裝在顯微鏡的攝像機(jī)端口上。

與激光掃描共聚焦相比，轉(zhuǎn)盤式共聚焦具有高速，高靈敏度，易于安裝等優(yōu)點(diǎn)，更適合研究活細(xì)胞及其內(nèi)部動(dòng)態(tài)過(guò)程。

入射光通過(guò)轉(zhuǎn)盤的比率稱為透射率T，可用如下公式計(jì)算:

D：針孔直徑；S：針孔間隔距離。

針孔直徑?jīng)Q定了穿過(guò)針孔的光的多少——較大的針孔可以讓更多的光通過(guò)；而間隔距離決定了較長(zhǎng)尺度上的阻斷雜散光的能力。離焦平面足夠遠(yuǎn)的雜散光會(huì)進(jìn)入相鄰的針孔，這一過(guò)程稱為針孔串?dāng)_（Pinhole cross-talk）。串?dāng)_的程度取決于樣品，樣品越厚影響越大。增加間隔距離可以降低串?dāng)_，但代價(jià)是減少光的。

當(dāng)我們帶入典型值D=25μm和S=250μm，可以得到透射率僅為1%，說(shuō)明絕大多數(shù)光（主要是雜散光）都可以被阻擋。然而，激發(fā)光強(qiáng)和相機(jī)靈敏度仍然是決定圖像質(zhì)量的關(guān)鍵。

轉(zhuǎn)盤照明光的透射率可以通過(guò)微透鏡進(jìn)行提高。圖5為Yokogawa公司設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)盤裝置，它由兩個(gè)同軸排列的圓盤組成，每個(gè)圓盤包含大約20000個(gè)針孔。上圓盤在下圓盤每一個(gè)針孔對(duì)應(yīng)的位置都裝有微透鏡，將入射光直接聚焦在下圓盤的針孔上，再照射到樣品上。通過(guò)添加微透鏡盤，可以將透射率提高一個(gè)數(shù)量級(jí)（Inoue and Inoue 2002），進(jìn)一步降低了激發(fā)光強(qiáng)度。

圖5：微透鏡圓盤通過(guò)主圓盤的針孔聚焦照明光。發(fā)射光被分色鏡分離進(jìn)入相機(jī)（Graf, Rietdorf and Zimmermann 2005）。

針孔直徑是轉(zhuǎn)盤式共聚焦系統(tǒng)的一個(gè)重要參數(shù)。針孔過(guò)大會(huì)降低軸向分辨率。針孔過(guò)小又會(huì)導(dǎo)致照明光過(guò)度衍射和過(guò)度阻擋發(fā)射光，降低圖像對(duì)比度。通常來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)盤針孔直徑都會(huì)由制造商針對(duì)60倍或100倍油鏡進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)于給定物鏡的系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，有三個(gè)關(guān)鍵參數(shù)決定了針孔直徑（Dopt）：