引言

中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康研究所、寧波大學(xué)食品與藥學(xué)院中國食品科學(xué)與技術(shù)系、島津企業(yè)管理(中國)有限公司聯(lián)合研究，成功建立并驗(yàn)證了適用于血清中多種維生素D代謝物的高通量、高靈敏度SFC-MS/MS分析方法。

由于研究內(nèi)容較多，故分為上、下兩期來進(jìn)行詳細(xì)介紹。本期主要介紹內(nèi)容為：研發(fā)背景、樣品前處理、如何建立及優(yōu)化SFC-MS方法等。

文章出處

Journal of Chromatography B 1120 (2019) 16-23

島津Nexera UC全相系統(tǒng)之SFC-MS系統(tǒng)

本研究采用島津超臨界流體色譜儀Nexera UC、島津三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀LCMS-8060

超臨界流體與改性劑配合使用，可在更大范圍內(nèi)滿足不同極性化合物的檢測需要；

低死體積和背壓控制單元有效降低脈動(dòng)，提高靈敏度；

溶劑使用量少且分析時(shí)間短，是一種綠色環(huán)保、有效的分析手段。

研究背景

維生素D（VD）作為一種脂溶性類固醇，在鈣穩(wěn)態(tài)和骨骼健康中起著重要作用，其主要以麥角鈣化醇（VD2）和膽鈣化醇（VD3）兩種形式存在，多通過皮膚光照和食物或膳食補(bǔ)充劑來獲取。VD進(jìn)入體內(nèi)參與生物調(diào)控，須在肝臟及腎臟內(nèi)進(jìn)行羥基化等復(fù)雜的代謝途徑反應(yīng)，因此其代謝產(chǎn)物結(jié)果是VD臨床評(píng)價(jià)的主要挑戰(zhàn)之一。

對(duì)于正常人血清或血漿中含有痕量1,25-(OH)2 VD2和1,25-(OH)2 VD3，分析時(shí)應(yīng)考慮進(jìn)一步改進(jìn)定量限(如衍生化)。與LC-MS/MS法相比，采用超臨界流體色譜儀（SFC）作為質(zhì)譜前端，不僅降低了有機(jī)溶劑成本，還有具有更快分析速度及更高靈敏度。

樣品前處理

采用3.5 mL真空血管采集空腹血樣，凝固后1500 ×g離心30 min。上層血清移入無菌管，-80℃保存后用于分析。

建立及優(yōu)化SFC-MS分析方法

1. SFC色譜柱的選擇

考察了10種VD代謝物分別在Diol、CN、NH2、PFP和C18 5根色譜柱上的洗脫性能，并評(píng)價(jià)了不同固定相的選擇性。如圖1，除C18柱外，其他4根色譜柱上VD代謝產(chǎn)物色譜峰均為正常的洗脫順序，保留時(shí)間隨羥基數(shù)量的增加而增加。其中PFP柱能夠分離所有VD代謝產(chǎn)物，分離效果較好，特別是25-OH VD2/VD3及其對(duì)映體的分離，并被選擇用于進(jìn)一步開發(fā)。

圖1：A) Diol, B) CN, C) NH2, D) PFP, E) C18色譜柱上VD代謝產(chǎn)物的固定相化學(xué)結(jié)構(gòu)和洗脫順序。

1: 25-OH VD3和3-epi-25-OH VD3;
2: 25-OH VD2和3-epi-25-OH VD2;
3: VD3; 
4: VD2; 
5: 1,25-(OH)2 VD3; 
6: 1,25-(OH)2 VD2;  
7: 24，25-(OH)2 VD3; 
8: 24，25-(OH)2 VD2。