透射電子顯微鏡所需的高真空度（TEM）減弱了研究自然存在于水相中的標(biāo)本的能力：將“濕”標(biāo)本暴露在遠(yuǎn)低于水蒸汽壓的壓力下，將導(dǎo)致水相在柱中迅速沸騰，對標(biāo)本的結(jié)構(gòu)造成破壞性后果。因此，在常規(guī)TEM中使用了各種方法在檢查前干燥標(biāo)本——這是一個準(zhǔn)備步驟，通常與限制結(jié)果重要性的偽影有關(guān)。

冷凍透射電子顯微鏡

一種解決標(biāo)本制備過程中干燥問題和顯微鏡真空中水分揮發(fā)性問題的方法是在-180°C及以下的特殊支架中，以升華速率在冷凍狀態(tài)下檢查樣品。這項技術(shù)被稱為冷凍透射電子顯微技術(shù)（冷凍TEM）或透射冷凍電子顯微技術(shù)，在過去幾十年中已成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)中不可或缺的工具，并且隨著冷凍電子斷層掃描的出現(xiàn)，在細(xì)胞生物學(xué)中也同樣必不可少。

對于本質(zhì)上足夠薄的樣品，如孤立的大分子復(fù)合物、病毒或小細(xì)胞，冷凍TEM的標(biāo)本制備基本上可以簡化為一個步驟：通過沉浸式凍結(jié)（浸沒冷凍）物理固定。本文介紹了這種技術(shù)的基本原理和缺陷，并隨附一篇文章介紹了幾種的應(yīng)用。

沉浸式凍結(jié)

圖1：準(zhǔn)備網(wǎng)格

成功可視化嵌入冰中的樣品的一個先決條件是，在短時間內(nèi)將水分子固定在適當(dāng)?shù)奈恢?，不允許形成冰晶，理想情況下會形成無定形凍結(jié)（玻璃化）水。在沉浸式凍結(jié)的情況下，只有使用具有高導(dǎo)熱性的合適制冷劑，并且快速浸入樣品以確保整個樣品快速冷凍，才能實現(xiàn)嵌入冰中的樣品的可視化。合適的制冷劑包括液化乙烷、丙烷或二者的混合物[1]，使用溫度略高于熔點（分別為-183℃，純化合物為-188℃）。此外，標(biāo)本內(nèi)的任何一點到暴露于制冷劑的表面的距離短，即樣品非常薄。

冷凍TEM中的標(biāo)本載體為標(biāo)本提供良好的支撐，但幾乎沒有背景來進(jìn)一步降低典型未染色冷凍樣品的低對比度。它們還導(dǎo)電，以避免標(biāo)本帶電和相關(guān)問題，如漂移。所有這些要求在一定程度上都可以通過帶有穿孔碳膜的標(biāo)準(zhǔn)TEM網(wǎng)格（實驗室制造或商用）得到滿足。后者具有非常規(guī)則大小和位置的孔，便于自動數(shù)據(jù)采集?？赡苄枰褂幂x光放電/等離子體清洗或基質(zhì)蛋白涂層對網(wǎng)格進(jìn)行預(yù)處理，以允許水溶液均勻擴(kuò)散或細(xì)胞附著。

對于基本沉浸式凍結(jié)，用鑷子固定在類似切紙機(jī)的裝置中（圖1），涂抹少量（3–5µl）水溶液中的標(biāo)本，并用濾紙吸干溶液的主要部分，以減少殘留層的厚度。這一步驟對于玻璃化（見上文）和達(dá)到顯微鏡電子束可穿透的厚度都是必要的，對于大多數(shù)樣品，無需采取進(jìn)一步的制備步驟。厚度取決于樣品和可用的顯微鏡，通常冰層要盡可能薄，但厚度不超過500nm.這也在所述技術(shù)可以有效凍結(jié)的厚度范圍內(nèi)。

吸干后，立即將樣品迅速放入制冷劑中。冷凍后，樣品可以轉(zhuǎn)移到液氮中，在顯微鏡檢查之前幾乎無限期地儲存。

挑戰(zhàn)

圖2：徠卡EMGP半自動沉浸式凍結(jié)裝置

一個關(guān)鍵問題是通過足夠快的冷卻來生產(chǎn)玻璃狀冰，但也要將冰保持在這種無定形狀態(tài)：后者要求樣品保持在再結(jié)晶溫度以下。可以通過將網(wǎng)格保持在液氮以下或在冷氮氣氣體環(huán)境中，并預(yù)冷卻操作冷凍標(biāo)本所需的所有工具達(dá)到目的。

另一個主要問題是冷凍標(biāo)本的表面因濕度冷凝而受到污染，從而形成納米尺寸的冰晶。由于樣品將被冷凍成像并作為一個整體（與冷凍替代或Tokuyasu冷凍切片等通過后續(xù)處理步驟去除表面晶體的方法相比），這種污染將在TEM中作為高對比度特征而明顯，因此避免。這可以通過一些措施來實現(xiàn)，旨在降低周圍大氣的濕度和樣品暴露在該大氣中的時間：通常，是在除濕室，樣品應(yīng)保持在液氮以下，避免在樣品表面呼吸，所有轉(zhuǎn)移應(yīng)使用清潔工具在液相上方的干燥（和冷）氮氣環(huán)境中快速進(jìn)行，顯微鏡通過特殊的防污染裝置在目標(biāo)區(qū)域提供清潔的真空。

然而，即使是完全冷凍的樣品，如果在冷凍前的瞬間處理不當(dāng)，也無法產(chǎn)生有意義的結(jié)果。問題的一個潛在來源是，如圖1所示，儀器上的標(biāo)本溫度不受控制：位于含有液氮的容器上方的未定義位置，樣品可能暴露在室溫或冷氣體中，導(dǎo)致不良狀態(tài)。

在同一類型的儀器上，尤其是在上述推薦的濕度較低的房間中工作時，溶劑的蒸發(fā)可能會產(chǎn)生問題：根據(jù)[2]，在室溫和30%的環(huán)境濕度下，水以50nm/s的速率從薄膜中蒸發(fā)。溶劑的去除以及隨后鹽類和其他溶質(zhì)的富集顯然會嚴(yán)重影響從含水標(biāo)本中獲得的結(jié)果。

盡管經(jīng)驗豐富的研究人員可以使用圖1所示的基本工具取得非常有意義的結(jié)果，但上面提到的許多問題仍未解決。因此，實驗室已經(jīng)開始建造自己的儀器，包括環(huán)境室和自動吸干器。隨后，不同制造商推出了商業(yè)產(chǎn)品（回顧請參見[3]），包括徠卡顯微系統(tǒng)公司與維也納IMP/IMBA電子顯微鏡設(shè)施合作開發(fā)的徠卡EM GP沉浸式凍結(jié)裝置（圖2）。

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